Niektóre ważne miasta na mapie rzeki Ohio to Pittsburgh w Pensylwanii; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, Wirginia Zachodnia; i Evansville, Indiana. Inne godne uwagi miejsca wzdłuż rzeki Ohio to miasta Wirginii Zachodniej z Parkersburg, Wheeling i Weirton, a także Kentucky z Owensboro.
Rzeka Ohio zaczyna się w Pittsburghu. Stamtąd rzeka płynie na północ przez miasta Pensylwanii Sewickley, Coraopolis, Ambridge i Aliquippa. W mieście Rochester rzeka Ohio skręca na zachód. Następnie rzeka przechodzi przez miasta Beaver i Midland, zanim dotrze do granicy Pensylwanii ze stanem Ohio.
Po przejściu przez miasto Ohio, East Liverpool, rzeka obraca się na południe. Trasa rzeki wyznacza granicę Ohio z Zachodnią Virginią. Miasta po stronie Ohio rzeki to Steubenville, Martins Ferry, Marietta i Gallipolis. Miasta po zachodniej stronie Wirginii to Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant i Huntington.
Wokół hrabstwa Ironton w stanie Ohio rzeka Ohio zaczyna definiować granicę między stanami Ohio i Kentucky. Niektóre miasta Kentucky przez granicę z Ohio to Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville i Newport. Po przejściu rzeki Cincinnati rzeka zaczyna definiować granicę Kentucky z Indianą. Po minięciu miasteczka Mount Wilson w stanie Indiana, rzeka Ohio definiuje granicę Kentucky z Illinois. Rzeka Ohio wpada do rzeki Mississippi w Kairze, Illinois.
