Etap odbarwiania jest najbardziej krytyczny w barwieniu metodą Grama. Wynik tego etapu opiera się na tym, jak łatwo komórka uwalnia kompleks krystaliczny fiolet-jod.
Odkryty przez dr Hansa Christiana Grama w 1884 r. Barwienie metodą Grama jest barwieniem różnicowym, używanym do identyfikacji bakterii. Dzieląc komórki bakteryjne w dwóch głównych grupach (Gram-dodatnia i Gram-ujemna), jest to narzędzie krytyczne przy klasyfikowaniu i różnicowaniu bakterii. Dwa wymagane plamy to podstawowy i kontrastowy. Nadmierne odbarwianie powoduje zniknięcie pierwotnego zabarwienia, a Gram-dodatnie - Gram-ujemne. Z drugiej strony podbarwienie nie usuwa kryształowego kompleksu jodu, który powoduje, że bakterie Gram-ujemne wydają się dodatnie.
