Najważniejsze znaczenie tlenu ma to, że ma krytyczne znaczenie dla oddychania komórkowego u wszystkich organizmów tlenowych. Oxygen ma również zastosowania medyczne, w tym terapię tlenową, obróbkę wysokociśnieniową oraz kombinezony ochronne do eksploracji kosmosu i głębin morskich. Tlen niszczy szkodliwe bakterie w ludzkich ciałach i służy do leczenia ofiar tlenku węgla.
Tlen jest jednym z najważniejszych wymagań życia, bez którego organizmy na Ziemi nie przetrwałyby. Organizmy żywe generują energię z pożywienia poprzez proces oddychania. Umożliwia to ludziom i innym organizmom wykonywanie codziennych zadań. Niewłaściwy metabolizm osłabia komórki i powoduje utratę naturalnej odporności, czyniąc je podatnymi na wirusy, które mogą prowadzić do fatalnych warunków zdrowotnych. Tlen jest stosowany w mitochondriach do wytwarzania trójfosforanu adenozyny podczas fosforylacji oksydacyjnej. Dodatkowo jest stosowany w szpitalach u pacjentów z trudnościami w oddychaniu. Terapia tlenowa zwiększa poziom tlenu we krwi pacjenta i obniża opór przepływu krwi u pacjentów z chorobami płuc, co zmniejsza obciążenie pracą serca. Podobnie aparaty oddechowe są używane przez astronautów, alpinistów i kierowców nurków. Inne zastosowania tlenu obejmują uzdatnianie wody i spalanie chemiczne.
Tlen jest stosowany w wielu przemysłowych aplikacjach chemicznych, w tym w produkcji kwasu siarkowego, kwasu azotowego i innych związków. Tlen przemysłowy służy do cięcia, spawania i topienia metali. Tlen atmosferyczny służy do generowania energii dla funkcji przemysłowych, generatorów i statków. W handlu w przemyśle stalowym stosuje się tlen do produkcji stali i żelaza w wielkich piecach.
