Fosforylacja oksydacyjna zachodzi w błonach mitochondrialnych i wokół nich w komórkach eukariotycznych. Utleniająca fosforylacja jest procesem generowania trójfosforanu adenozyny, głównej waluty energii wszystkich komórek, poprzez użycie tlenu jako elektronu końcowego akceptor. Dwa główne etapy fosforylacji oksydacyjnej to transport elektronów i chemiosmoza, z których obie wykorzystują ruch naładowanych cząstek do przesyłania energii.
Fosforylacja oksydacyjna jest główną metodą, dzięki której komórki eukariotyczne wytwarzają ATP w warunkach tlenowych. Etap przed fosforylacją oksydacyjną, glikolizą, tworzy ATP, ale w znacznie mniejszych ilościach. Glikoliza zachodzi również z dala od mitochondriów. Fosforylacja oksydacyjna rozpoczyna się od użycia transportu elektronów w celu przemieszczania elektronów między różnymi cząsteczkami w mitochondriach. Służy to także do wyciągania protonów, które są jądrami wodoru bez elektronów, przez błonę mitochondriów. Ten ruch jest w obszarze o wyższej koncentracji przeciwko tendencjom dyfuzji. Jako taki wymaga energii.
Gdy elektrony przestaną poruszać protonami, zostają uwolnione, by powrócić na drugą stronę błony mitochondrialnej w procesie znanym jako chemiosmoza. Proces przesuwania protonów w jednym kierunku wymagał energii, a spontaniczny ruch z powrotem przez membranę ją zwalnia. To właśnie ta energia służy do wiązania grupy fosforanowej z ADP, tworząc ATP.
